1.细胞悬液混匀:按照实验要求的浓度准备细胞，在培养基瓶、培养瓶或其他容器中混匀。建议的工作容积为每层30-50 mL.

2.用移液管紧贴瓶壁缓慢地将液体加到五层细胞培养瓶中，避免产生泡沫或者气泡(每次加液时移液管内液体可留少许)。

注意事项: 10 ml移液管可以伸到培养瓶底部使培养基分散开，而25 mL移液管则只能伸到NEST标志的地方把液体分散开。

3.把培养瓶有NEST标志那一侧朝向自己，顺时针做斜45度左右放置一段时间，使瓶中各个隔层的液体达到平街。

4.轻缓地将培养瓶水平放置于工作台上，有NEST标志那一面朝上。

5.前后左右轻轻晃动多层瓶，液体会均匀地分布在五个生长面上。

注意事项:摇晃的动作要轻柔，一方面是防止起泡沫，另一方面是要防止培养基港漏到下层中。

 抽吸法 

抽吸的时候，将多层瓶做斜45度，有NEST标志的一面朝向自己。

将移液管伸到底部抽吸培养基，直至完全抽吸完。

 倾倒法 

将有NEST标志的一面朝向自己，逆时针45度倾倒液体。

注意事项: 抽吸培养液时建议使用10 mL移液管，才能将培养液吸尽。

1.用缓冲液清洗一遍以去除残留的血清，后加入消化液 (> 5 mL层)，混匀。

2.消化大约2 min (视细胞情况而定) ，用消化终止液中和消化液

3.采用移液管抽吸法或做倒法将细胞悬液置于离心管等容器中。

4.用一定量的缓冲液冲洗多层瓶三次，将冲洗液分别置于离心管中,混匀计数或者传代接种。