划重点：
1.iPSC培养过程中不建议使用抗生素，抗生素会影响细胞的活性和分化潜能。
2.iPSC培养环境应与其它细胞隔离，两次传代后检测支原体。
01基质胶用于多孔板的包被：
（1）将Gelnest™基质胶(干细胞专用)置于冰中并在4℃融化，使用预冷的移液管或吸头混合基质胶至均匀状态。
注：GelNest™基质胶是由小鼠肿瘤组织中提取的基底膜成分制备而成，包含的主要成分有层粘连蛋白、IV型胶原蛋白硫酸肝素糖蛋白等，更含有多种多种生长因子。这些成分可以提供细胞黏附、分化和增殖所需的支持和信号，模拟生理环境中基底膜的特性，从而进一步模拟生理环境中的细胞信号通路和互动，提高细胞培养的成功率和效果。
（2）在冰上，将基质胶与DMEM培养液按照1:80或1:100的比例混匀，例如取1mL基质胶加入80mL或100mL DMEM培养液中，使用预冷的移液管混合至均匀状态。
注：可根据实验具体情况调整稀释比例。
（3）将6孔板置于冰上，按照每孔1mL向6孔板中加入稀释后的基质胶。
（4）将6孔板置于37℃孵育过夜。
注：一般情况下，孵育1小时即可使用，但过夜孵育的细胞培养效果更好。
（5）使用前吸出未结合的基质胶。
注：需确保移液管的尖端不会刮伤涂层表面。
02 Y-27632 （ROCK抑制剂）溶液的配制
将Y-27632 溶于PBS中，配制成10mM的Y-27632溶液，例如取2.47mg Y-27632溶于1mL PBS中，即得1mL 10mM Y-27632溶液。
注：Y-27632的工作浓度为10µM。
03配制含Y-27632的人胚胎干细胞培养液（如mTeSR™1或TeSR™-E8™）
取Y-27632溶液与mTeSR™1培养液按照1:1000的比例混匀，例如取10µl Y-27632溶液加入10mL mTeSR™1培养液中，即得10mL含10µM Y-27632的mTeSR™1培养液。
04 iPSC复苏：
（1）将冻存的iPSC置于37℃水浴迅速解冻，将细胞溶液转移至离心管中，用DMEM培养液冲洗冻存管两次并转移至离心管中，与管中细胞合并，室温300×g离心5分钟。
（2）弃上清，用2mL含Y-27632的mTeSR™1培养液重悬iPSC，随后将细胞悬液转移至基质胶包被好的6孔板的1个孔中，置于培养箱中培养。
注：建议将每支复苏的细胞(约100万个)转移至6孔板的1个孔中培养使细胞存活率最大化。
（3）第二天对iPSC进行换液，将含Y-27632的mTeSR™1培养液更换为不含Y-27632的mTeSR™1培养液。
注：可使用耐思新推出细胞复苏仪替代原始细胞复苏过程，细胞复苏时间短，细胞存活率高。
05 iPSC传代：
注：iPSC细胞生长至单层后会迅速分化并死亡，为保持其活性和多能性，需在长满前进行传代。
（1）去上清，用1mL PBS洗涤1次，加入1mL适当的细胞消化液
（2）将培养板转移至培养箱中孵育3分钟。显微镜下观察，大部分细胞脱落，若细胞仍附着，可以用手轻轻拍打培养板底部使细胞脱落。
（3）将消化下来的细胞转移至离心管中，用DMEM培养液洗涤培养板表面两次并转移至离心管中，与管中的细胞合并，室温300×g离心5分钟。
（4）弃上清，用含Y-27632的mTeSR™1培养液进行重悬，随后将细胞悬液转移至基质胶包被好的6孔板中，置于培养箱中培养。
06iPSC冻存：
NEST生物样本库系列含有全规格细胞冻存管及冻存液，操作简单，安全无菌。
（2）参考细胞冻存液的相关步骤进行细胞消化。
（3）计数，弃上清，加入适量冻存液，以每管1mL冻存液（约100万个细胞）分装至冻存管中。
（4）将细胞冻存管放置于可逐步降低温度的NEST程序降温盒内并放置在-80℃冰箱内，确保冷却速度约为1℃/分钟。通常冷却速度不宜快于0.5℃/分钟。
（5）放置在-80℃冰箱内约24小时后转移至液氮气相中保存。
iPS细胞的成功诱导给细胞治疗及再生医学研究开辟了全新的道路。相信在不久的将来，iPSC技术能快速突破瓶颈，NEST也将持续研发新品，推动再生医学的蓬勃发展，为患者带来新生的希望！
