#酶联免疫吸附试验（ELISA）实验#
酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种对目的分子（如肽、蛋白、抗原、抗体和小分子等）定性或定量的检测方法，也是目前应用最广泛的免疫学检测技术之一。鉴于其强大的特异性和便捷性，ELISA通常被视为生物样品定量检测的金标准。
它基于一种酶标记抗体，能够检测固定在96孔或384孔酶标板上的抗原，加入的底物可以产生与原始样品中存在的抗原量相关的颜色变化或光信号。这是一种简单而快速的技术，用于检测附着在固体表面的抗体或抗原。作为最敏感的免疫分析方法之一，ELISA在实验室研究、疾病生物标志物诊断和各个行业的质量控制方面具有商业价值。
ELISA操作方便、特异性强、数据分析简单、既可定性也可定量，结果明确易于解释。酶标板（ELISA Plate）是酶联免疫吸附实验（ELISA）中不可或缺的工具。
ELISA作为研究工具
许多研究领域都会用到ELISA技术，其可以帮助研究人员了解细胞和组织中蛋白质的表达和调控，如磷酸化特异性和总蛋白评估、分泌蛋白表达、翻译后修饰评估、免疫学研究、神经学研究、癌症研究等。
ELISA在药物的研发与监测中也发挥着重要作用，可用于筛选化合物库，以确定其与特定蛋白质的结合能力，从而识别潜在的候选药物以供进一步开发。同时，ELISA可用于监测血液或尿液中的药物或其代谢物的水平，以确保药物处于治疗水平且无毒性。
ELISA作为诊断工具
除了用于科学研究之外，ELISA还广泛用于诊断检测，包括对病毒感染、过敏测试、毒性和癌症的诊断检测，是一种快速便捷的临床检测手段，这种检测在扩展后可同时检测多份样品。
酶标板怎么选
酶标板的主要材质是聚苯乙烯（PS），通过疏水键、离子键或共价结合等方式，将抗原、抗体等生物分子吸附到板孔内表面。
根据实验的需求选择合适的酶标板，是实验成功的第一步。
NEST酶标板经表面处理后蛋白结合能力大大増强，可达300－400ng IgG/cm2，主要结合的蛋白分子量>10kD，使用该类酶标板可提高敏感性，并可相对减少包被蛋白的浓度和用量。
Part.01
不同颜色
选择合适的酶标板颜色取决于实验的具体需求和条件。目前NEST有透明、白色及黑色三款酶标板可供选择。
▶ 透明酶标板：
适用场景：主要用于光吸收检测，如细胞培养和常规比色分析。
注意事项：不适合发光检测，因为光会向各个方向发散，影响检测结果。
▶ 白色酶标板：
适用场景：高反光性，适合化学发光和底物显色检测，灵敏度高。
注意事项：适用于较弱的光检测，如一般的化学发光和底物显色。
▶ 黑色酶标板：
适用场景：光吸收特性强，适合荧光检测，有效消除背景干扰。
注意事项：适用于检测较强的光，如荧光检测；也可以减少非特异反应的影响。
Part.02
可拆卸&不可拆卸
▶ 不可拆酶标板：板条与板架连为一体；
▶ 可拆酶标板：板条与板架分离，单孔可拆，灵活性高，尤其适合样本量不固定的实验，避免不必要的浪费。
拆装动作
当需要将板条拆下时，可从板条正面两端轻轻向上掰动，然后抠取下来，如上图所示。
若板条太紧难以掰动，可用手指抵住板条底部轻轻向上顶，然后如上图将板条抠取下来。
务必要戴好无尘手套，以免污染板条而影响板条的透光性。
不可从板条的一端强行掰取，容易造成板条断裂。
在装板条时，要注意方向，板条两端分别设计成方形和半圆形，半圆形那端必须装在有凸起台阶的卡槽内（箭头所在处），切勿装反。
将板条装入板框后，在两侧和中间部位都需要进行按压，压实后方可进行后续实验。
ELISA常见Q&A
Q1
包被过程有哪些注意事项？
▶ 包被抗原或抗体的浓度要合适，需通过预实验进行优化。一般来说，浓度过低会导致信号较弱，过高则可能引起非特异性结合增加。
▶ 包被的温度和时间要严格控制，通常在 4℃过夜或 37℃孵育 1 - 2 小时。
▶ 包被液的 pH 值也会影响包被效果，不同的抗原或抗体可能需要不同的 pH 值环境。
Q2
洗涤步骤为什么很重要？
洗涤的目的是去除未结合的抗原、抗体及其他杂质，减少非特异性信号。如果洗涤不充分，残留的杂质会与酶标抗体结合，导致背景值升高，影响实验结果的准确性。在洗涤过程中，要注意洗涤液的用量、洗涤次数及每次洗涤的时间，一般需洗涤 3 - 5 次。
Q3
如何避免加样误差
使用高精度的移液器，并定期进行校准。在加样前，要将样本和试剂充分混匀，但要避免产生气泡。加样时，缓慢释放液体，确保加样量准确。同时，要注意避免交叉污染，每加完一个样本或试剂，都要更换吸头。
Q4
如何判断 ELISA 实验结果的有效性？
若使用病毒、质粒或其他载体用于细胞或动物的转染/感染来研究基因/蛋白的功能影响时，载体携带了荧光蛋白，则二抗荧光选择时或载体荧光蛋白选择时，荧光蛋白和二抗携带荧光素的激发波长和发射波长应互相不能干扰，防止影响正确的荧光结果的观察
Q5
免疫荧光信号较弱
▶ 看阴性对照和阳性对照是否符合预期。
阴性对照的吸光度值应低于设定的阈值，阳性对照的吸光度值应在规定的范围内，且阳性对照与阴性对照之间有明显的差异。
提高靶标蛋白的表达量.
▶ 看标准曲线的线性关系
相关系数（R²）应大于 0.99，说明标准曲线拟合良好。
▶ 看样本的吸光度值
应在标准曲线的范围内，否则需要对样本进行稀释后重新检测。
Q6
实验结果出现高背景的原因有哪些？
▶ 可能是包被抗原或抗体的浓度过高，导致非特异性结合增加
▶ 封闭不充分，固相载体上还有未被封闭的位点与酶标抗体结合
▶ 洗涤不彻底，残留的杂质与酶标抗体发生非特异性反应
▶ 酶标抗体的浓度过高或孵育时间过长
▶ 底物溶液保存不当，发生了非特异性显色等
Q7
如何进行 ELISA 实验的质量控制？
▶ 在实验前，要对试剂和仪器进行质量检查，确保其性能良好。
▶ 实验过程中，要严格按照标准操作规程进行操作，设置阴性对照、阳性对照和标准品，以监控实验的准确性和重复性。
▶ 定期对实验结果进行回顾性分析，总结经验教训，及时发现和解决问题。
▶ 参加室间质量评价或与其他实验室进行比对也是质量控制的重要手段。
Q7
如果实验结果出现异常，应该如何处理？
▶ 仔细检查实验操作过程，看是否有失误，如加样错误、孵育时间或温度不正确、洗涤不充分等。
▶ 如果操作没有问题，可重新检测样本，同时更换试剂，以排除试剂的问题。
▶ 如果结果仍然异常，要考虑样本本身的因素，如样本保存不当、样本中存在干扰物质等。
▶ 必要时，可采用其他检测方法对样本进行验证，以确定实验结果的可靠性。
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