细胞复苏流程

1.从液氮罐中取出冻存细胞，放入37℃水浴锅中融化，轻柔离心后收集细胞沉淀；

2.缓慢用移液枪吸去上清，加入适量浓度和体积的完全培养基，重悬细胞沉淀，转移至细胞培养皿或细胞培养瓶；

3.根据细胞培养皿或者培养瓶的体积，补足完全培养基，放入二氧化碳培养箱中培养观察。

操作中的注意事项&小妙招

①    小心取出冻存管

许多小型液氮罐的设计是将细胞冻存在带盖的提篮中，提篮会浸没在液氮中。由于提篮中没有孔格的划分，细胞冻存管无法摆放整齐。取用细胞时候，实验人员经常需要逐一查看，寻找计划复苏的细胞，此过程耗时过久，可能会导致其他冻存管内的细胞受损。

一般大型液氮罐会配置成列的冻存架和细胞存储盒，取出冻存架和放回都需要平稳小心处理，避免带出大量液氮。罐内液氮较多时，可适当在罐口附近停留，等大部分液氮回流后再拎出。

②    快速融化待复苏细胞

当找到准备复苏的冻存管后，不要着急放入水浴锅，先检查封口膜是否完整（关于冻存细胞时，是否用封口膜的问题，有经验的呢，都会发现加不加都一样的），如果贴了医用胶布，胶布是否有破损？因为一旦冻存管中有液氮流入，直接放入水浴锅中，管内压力骤升，可能导致冻存管炸裂，危及实验人员。推荐使用内旋的冻存管，不宜爆炸。如果只有外旋的冻存管，取出后应尽快倒置/水平放置数十秒，使得液氮流出。

复苏细胞的核心技术，简而言之就是快融。从液氮罐中取出的细胞，需及时放入37℃水浴锅，进行快速融化，期间需不停地轻柔摇晃冻存管。最好在两分钟内完全融化细胞。出于卫生考虑，有些细胞房没有水浴锅，所以很多复苏操作，需要在不同实验室进行。如果两个实验室距离较远，且实验室室温较高，可提前准备一只干净的烧杯，装入37℃的水作中间缓冲。

注意

?      复苏时不要让水浴锅中的水，流入冻存管中造成污染。

?      复苏过程中要格外注重无菌操作，经水浴锅融化后，需对冻存管消毒。最好同时更换手套和口罩，全程避免移液器接触管口及管壁。小妙招：将冻存管放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。

③    轻柔收集细胞

收集细胞前，要将所用培养基提前预热并摆放整齐，避免现用现配耽误复苏进程，及时让刚复苏的细胞接触正常的生长环境。若冻存液中存在DMSO，请根据所用细胞对其敏感的程度，判断要不要离心弃除。离心目的，一个是去除DMSO，一个是去除死细胞。

刚复苏的细胞状态比较脆弱，应避免多次吹打和离心。比如原代细胞在复苏融化后，尽量不要进行离心操作，直接补足培养基，使细胞分散均匀，等3-6小时，细胞贴壁后，进行换液处理。此方式也适用于其他冻存状态一般的细胞。

④    培养前，计数&活力检测

复苏过程中，细胞计数必不可少。原则上，冻存前和复苏后，都需要对细胞进行计数和活率分析，判断冻存的效果和细胞复苏后的状态。

2018年9月，美国药典（USP-NF）出台了关于细胞冻存相关政策并明确指出，台盼蓝不能很好地识别刚复苏的细胞（细胞的种类和台盼蓝的浓度不同，对染色结果都有较大的影响），建议使用两种以上的方法进行细胞计数，如结合荧光染色计数法。

⑤    支原体或细菌的污染。分离培养物，检测支原体。清洁支架或培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。建议使用的培养基提前用一次性真空过滤器过滤一下，能有效除去支原体、细菌等，0.1μm的过滤器可以去除支原体，0.22微米去除细菌。

⑥    复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性，建议启用新的保种细胞。如果细胞比较珍贵或没有备份细胞，可尝试将不贴壁细胞收集离心，再用 PBS 将沉淀清洗一遍，离心后的沉淀加入胰酶重新消化接种，同时提高血清浓度到 15%~20%。

复苏后是否成功，根据接种后细胞的形态和贴壁率而定，倘若第二天有95%以上的细胞贴壁，且形态良好，则说明复苏成功。复苏接种的时候，采用较高的接种密度，使细胞的整体密度高一些，有利于细胞的生长。