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文章名称：Lung metastasis and recurrence is mitigated by CAR macrophages, in-situ-generated from mRNA delivered by small extracellular vesicles

中文名称：由小型细胞外囊泡递送mRNA在体内生成的CAR巨噬细胞可显著抑制肺癌转移与复发

杂志名：nature communications

期刊影响因子：15.7

第一作者：Yuchen Xiao, Tianchuan Zhu

通讯作者：Xi Huang

发表日期：2025.8.4

https://doi.org/10.1038/s41467-025-62506-2

研究内容

概述：

本文设计了一种吸入式的纳米递送系统：

把编码CAR（靶向间皮素）的 mRNA 放到小型细胞外囊泡（sEV）里，并在囊泡表面装上能识别 M2 型巨噬细胞表面受体 CD206 的单链抗体片段。

这样吸入后，这些带有识别标记的囊泡会在肺里累积，并被M2 巨噬细胞摄取。囊泡里的mRNA 在巨噬细胞内被翻译为 CAR 蛋白，从而把这些巨噬细胞改造为有抗肿瘤吞噬能力的 CAR-M。

与体外培养再回输的细胞疗法相比，这种原位（in-situ）生成 CAR-M 的方式，避免了复杂的细胞制造过程，并减少了全身给药导致的肝脏富集问题。

动物实验表明：吸入给药能减少肺转移肿瘤量、延长生存，并促进免疫记忆，能有效抑制肿瘤复发。

研究背景

肿瘤的转移与复发，是导致癌症死亡的主要原因。肺是常见的转移位点，传统的CAR-M（嵌合抗原受体改造的巨噬细胞）在治疗实体瘤上前景不错，但面临制造复杂，以及静脉注射后主要在肝脏累积以至肺可达性差等问题。本文提出：如果能在肿瘤所在器官（肺）原位把巨噬细胞改造成CAR-M，就能避开这些问题并提升治疗效果。

实验方案

1.sEV 设计与制备

构建表达mesothelin（MSLN）特异性 CAR 的 mRNA（CAR^{mRNA}）；并将其装载进工程化的小型细胞外囊泡（sEV）。

在sEV 表面整合 anti-CD206 scFv（记作 aCD206）以靶向 M2 型巨噬细胞，并通过额外修饰（如 L7Ae/C-box 模块、Cx43 修改等）提高 mRNA 装载与递送效率。对 sEV 的形貌（TEM）、蛋白标志（CD63、TSG101 等）和 mRNA 含量做了表征。

2.体外验证（巨噬细胞培养与功能验证）

用骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）极化成 M2 型后，检测 sEV 的摄取（internalization）、CAR mRNA 的翻译（用 EGFP 替换 CAR 作示踪）、以及 CAR 蛋白的表达（流式/免疫荧光/Western blot）。

评估CAR-M 的功能性：对靶细胞（B16 小鼠黑色素瘤细胞构建的 MSLN 表达系）进行吞噬实验、细胞毒性实验、细胞因子释放检测等。

3.免疫细胞互作与转录/信号通路检测

用Transwell 共培养（sEV 处理后的 BMDM 在下室，T 细胞或 DC 在上室）评估 CAR-M 对 T 细胞增殖、DC 成熟等的旁分泌/抗原呈递影响（用 CFSE 标记 T 细胞，流式分析）。同时用 qPCR / heatmap / western blot 检测吞噬后上调的信号通路（如 AKT、NF-κB、ERK）。

4.体内给药与抗肿瘤疗效

在小鼠肺转移模型中比较吸入（inhalation）与静脉注射两种给药方式的组织分布（Fluc 或 DiR 示踪）、巨噬细胞中 CAR 表达、肿瘤生长（生物发光、病理切片）、肿瘤微环境（流式细胞谱系分析、细胞因子测定）和长期复发/生存率。

CAR^mRNA@aCD206 sEVs制备过程示意图

CAR^mRNA@aCD206在肺转移癌中的靶向递送及抗肿瘤机制。

实验结果

1.sEV 能有效加载并携带 CAR mRNA，工程化sEV 在形貌、表面标志与 mRNA 含量上得到良好验证。

2.体外：aCD206-修饰的 sEV 更易被 M2 BMDM 摄取，能够在细胞内产生 CAR（EGFP 示例证明翻译），并使巨噬细胞表现出增强的抗原特异性吞噬、释放更多促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α），在体外对 MSLN 阳性肿瘤细胞的吞噬与细胞毒性更强。

3.免疫互作：在Transwell 共培养中，CAR-M 能通过旁分泌或抗原递呈促进 T 细胞增殖并诱导 DC 成熟（Transwell 里上室的 CFSE-标记 T 细胞与 DC 的指标显示出明显提升），提示 CAR-M 有助于激活适应性免疫并可能引起“表位扩展”。

4.体内：吸入给药相比静脉注射能使sEV 在肺中更高富集并更有效地在肺巨噬细胞中诱导 CAR 表达（流式与组织免疫荧光证明）。吸入CAR^mRNA@aCD206 sEVs能显著抑制肺转移瘤负荷（生物发光、肉眼/HE切片），延长动物生存，并产生长期免疫记忆，同时肝脏富集问题明显缓解。

讨论

通过将CAR^mRNA 递送到肿瘤组织内的巨噬细胞，可在不进行复杂体外细胞制造的情况下产生功能性CAR-M，从而优化生物分布、增强局部抗肿瘤免疫，并减少系统性副作用。

该技术在肺转移模型上效果显著，并显示可诱导长期免疫记忆以预防复发。作者认为该sEV 平台具有推广到其他靶抗原和组织的潜力，但要注意提升 mRNA 载入效率、特异性靶向以及临床转化中的剂量和安全性评估。

论文中用到的NEST产品

细胞小室

使用到的NEST产品：细胞小室

1.T 细胞增殖实验

研究人员把CFSE 标记的 T 细胞放在 Transwell 上室，把巨噬细胞（BMDM/CAR-M）放在下室，检测是否能通过分泌因子促进 T 细胞增殖。结果显示：CAR-M 显著增强了 T 细胞的增殖能力。

2.树突状细胞成熟实验

将未成熟DC放在上室，巨噬细胞放在下室，共培养后检测 DC 的成熟标志物。结果显示：CAR-M 能有效促进 DC 成熟，增强免疫激活作用。

经过与B16-MSLN 细胞共孵育预处理后的 M2 型 BMDM，在 Transwell 实验中对 T 细胞增殖的影响

G 经过与 B16-MSLN 细胞共孵育预处理后的 M2 型 BMDM，在 Transwell 实验中对树突状细胞（DC）成熟（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）的影响

NEST细胞小室的优势

细胞小室在细胞实验中很常用，如：共培养实验、趋化实验、细胞迁移实验、细胞侵袭以及药物转运。其中，通透性支持物可以有效改善极性细胞的培养，因为这些支持物允许细胞从其基底面和顶面分泌和吸收分子，从而以更为自然的方式进行代谢，最大程度地模拟体内环境以培养某些特殊的细胞系。

▶创新的边缘设计：操作简单便捷，减少细胞损伤，保证实验重复性和准确性

▶PC（聚碳酸酯）膜：机械强度高，化学稳定性好，能承受多种实验条件，确保实验结果准确可靠，不易撕破或卷曲，且取出小室时操作方便

▶PET（聚酯）膜：具有良好的化学稳定性，兼容多种溶剂环境

▶兼容性好：与大部分细胞固定、染色溶剂兼容，便于后续显微观察和长期保存

▶低吸附特性：PC膜低吸附率，减少小分子蛋白和化合物的损失，确保实验数据真实可靠

▶孔径规格丰富：提供0.4μm至8μm的全规格孔径，提供6孔、12孔、24孔等多种规格配套多孔板，满足不同规模的实验需求

细胞小室订购指南